Unterschiedliche Wirkungen von Wasserstoff

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 7231 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Das Potenzial für präventive und therapeutische Anwendungen von H2 wurde inzwischen bei verschiedenen Krankheiten bestätigt. Allerdings sind die Auswirkungen von H2 auf den Gesundheitszustand noch nicht vollständig geklärt. Unsere vorherige Studie berichtete über Veränderungen des Körpergewichts und von 13 biochemischen Serumparametern während der sechsmonatigen Wasserstoffintervention. Um ein umfassenderes Verständnis der Auswirkungen eines langfristigen Wasserstoffverbrauchs zu erhalten, wurden in dieser Studie das Plasmametabolom und die Darmmikrobiota untersucht. Im Vergleich zur Kontrollgruppe wurden in der Gruppe mit wasserstoffreichem Wasser (HRW) bzw. in der Gruppe mit Wasserstoffinhalation (HI) 14 bzw. 10 Differenzialmetaboliten (DMs) identifiziert. Die Analyse der Signalweganreicherung zeigte, dass die HRW-Aufnahme hauptsächlich den Stärke- und Saccharosestoffwechsel beeinflusste und dass DMs in der HI-Gruppe hauptsächlich an der Arginin-Biosynthese angereichert waren. Die 16S-rRNA-Gensequenzierung zeigte, dass die HRW-Aufnahme signifikante Veränderungen in der Struktur der Darmmikrobiota hervorrief, während in der HI-Gruppe keine deutlichen Unterschiede in der Bakteriengemeinschaft beobachtet wurden. Die HRW-Aufnahme führte hauptsächlich zu einem signifikanten Anstieg der Häufigkeit von Lactobacillus, Ruminococcus und Clostridium XI sowie zu einem Rückgang von Bacteroides. HI führte hauptsächlich zu einer verringerten Häufigkeit von Blautia und Paraprevotella. Die Stoffwechselfunktion wurde durch metabolische Käfiganalyse bestimmt und zeigte, dass HI die freiwillige Aufnahme und Ausscheidung von Ratten verringerte, während die HRW-Aufnahme dies nicht tat. Die Ergebnisse dieser Studie liefern grundlegende Daten für die weitere Forschung zur Wasserstoffmedizin. Die Bestimmung der Auswirkungen von Wasserstoffeingriffen auf Mikrobiotaprofile könnte auch Aufschluss über die Identifizierung des Mechanismus geben, der den biologischen Wirkungen von molekularem Wasserstoff zugrunde liegt.

Wasserstoff (H2) ist das kleinste und leichteste Gasmolekül, das historisch als biologisch inertes Molekül galt. Anfang 1975 stellten Dole et al. berichteten zunächst über die mögliche krebshemmende Wirkung einer hyperbaren Behandlung mit 97,5 %igem Wasserstoffgas in einem Mausmodell eines Hauttumors1. Medizinische Forscher widmeten H2 jedoch erst dann große Aufmerksamkeit, wenn Ohsawa et al. berichteten, dass die Inhalation von 1–4 % H2-Gas die zerebrale Ischämie-Reperfusionsschädigung bei Ratten durch selektive Neutralisierung von Hydroxylradikalen und Peroxynitrit2 signifikant abschwächt. Das Potenzial für präventive und therapeutische Anwendungen von H2 wurde inzwischen in mehr als 170 verschiedenen menschlichen und tierischen Krankheitsmodellen bestätigt, darunter Ischämie-Reperfusionsverletzungen (I/R)3,4, Neurodegeneration5,6, Herz-Kreislauf-Erkrankungen7,8, metabolisches Syndrom9, 10, Entzündungen11,12 und Krebs13,14. Es wurden mehrere biologische Mechanismen vorgeschlagen, darunter die selektive Reduzierung zytotoxischer Sauerstoffradikale2, entzündungshemmende Wirkungen15, die Wiederherstellung der mitochondrialen Dysfunktion16 und die Regulierung des Stresses des endoplasmatischen Retikulums17, aber keiner von ihnen kann die vielfältigen biologischen Funktionen von H2 vollständig erklären.

Bei Säugetieren bildet das Darmmikrobiom ein komplexes Ökosystem, das aus einer großen Anzahl interagierender Bakterien, Archaeen, Bakteriophagen, eukaryontischen Viren und Pilzen besteht, von denen die meisten kommensale oder wechselseitige Mikroorganismen sind18. Im letzten Jahrzehnt wurde nachgewiesen, dass die Darmmikrobiota eine wichtige Rolle bei der Ausbildung der Immunität des Wirts, der Verdauung von Nahrungsmitteln, der Regulierung der endokrinen Funktion des Darms und der neurologischen Signale, der Modifizierung der Arzneimittelwirkung und des Stoffwechsels, der Eliminierung von Toxinen und der Produktion zahlreicher Verbindungen spielt, die den Wirt beeinflussen19. Derzeit ist die Forschung zum Zusammenhang zwischen Wasserstoffverbrauch und Darmmikrobiom relativ begrenzt. Die meisten Studien zeigten, dass wasserstoffreiches Wasser (HRW) die strukturelle Integrität des Darms und die Hochregulierung von Butyrat-produzierenden Bakterien verbessern und die klinischen Merkmale von Störungen der Darmmikrobiota verbessern könnte20. Diese Studien konzentrierten sich jedoch hauptsächlich auf die modulierende Wirkung des HRW-Verbrauchs auf die Darmflora bei pathologischen Zuständen. Ob die Verabreichung von HRW das Darmmikrobiom bei gesunden Tieren reguliert, bleibt weitgehend unbekannt. Darüber hinaus muss weiter untersucht werden, ob die Wasserstoffinhalation als weitere häufig verwendete Methode zur Wasserstoffaufnahme auch Auswirkungen auf das Darmmikrobiom haben könnte.

Eines der Ziele der vorliegenden Studie bestand darin, die möglichen regulatorischen Auswirkungen einer langfristigen HRW-Aufnahme und Wasserstoffinhalation auf das Darmmikrobiom zu untersuchen. Unsere vorherige Studie hat gezeigt, dass eine langfristige HRW-Aufnahme oder Wasserstoffinhalation einige biochemische Serumparameter normaler Ratten beeinflussen kann, was auf eine mögliche modulierende Wirkung des Wasserstoffverbrauchs auf den Stoffwechsel im Gesundheitszustand hinweist21. Um die Auswirkung des Wasserstoffverbrauchs auf den Stoffwechsel weiter zu untersuchen, wurde eine LC-MS-basierte pseudotargetierte Metabolomics-Analyse durchgeführt, um die Veränderungen der Plasmametabolitenspiegel zu bestimmen. Der Zusammenhang zwischen unterschiedlich exprimierten Plasmametaboliten und veränderten Darmmikrobiota wurde ebenfalls untersucht.

Wie in unserer vorherigen Studie21 berichtet, war das Körpergewicht (BW) der Ratten in der HI-Gruppe nach einer 6-monatigen Wasserstoffintervention im Vergleich zu den Kontrollen signifikant verringert (455,20 ± 31,57 g gegenüber 525,00 ± 17,78 g, p = 0,007). In der HRW-Gruppe wurden keine signifikanten Veränderungen im Körpergewicht beobachtet. Das Körpergewicht der Ratten war in der HI-Gruppe niedriger als in der HRW-Gruppe (455,20 ± 31,57 g vs. 498,80 ± 18,50 g, p = 0,012) (Abb. 1A).

Die Auswirkungen von Wasserstoffeingriffen auf das BW und die Stoffwechselfunktion von Ratten. (A) BW-Änderungen sechs Monate nach der Wasserstoffbehandlung; (B) BW-Änderungen im ersten Monat nach der Wasserstoffbehandlung; (C–F) die Auswirkungen der Wasserstoffbehandlung auf Nahrungsaufnahme (C), Wasseraufnahme (D), Stuhlgang (E) und Urinieren (F).

Um die Auswirkungen einer Wasserstoffintervention auf die Stoffwechselfunktion zu bestimmen, führten wir eine weitere Studie mit Stoffwechselkäfigen durch, um die freiwillige Aufnahme und Ausscheidung von Ratten während des ersten Monats der Wasserstoffintervention rund um die Uhr zu messen. Im Vergleich zur Kontrollgruppe hatten sowohl HRW als auch HI während der vier Wochen keinen signifikanten Einfluss auf das BW der Ratten, allerdings war das BW in der ersten Woche deutlich niedriger (263,29 ± 19,98 g vs. 296,56 ± 19,69 g, p = 0,012). und die vierte Woche (383,21 ± 29,36 g vs. 428,81 ± 31,21 g, p = 0,024) nach HI. Im Vergleich zur HRW-Gruppe war das BW der Ratten in der HI-Gruppe während der vier Wochen mit einer marginalen Signifikanz (p = 0,063) niedriger (Abb. 1B). Wie in Abb. 1C, D gezeigt, führte HI im Vergleich zur Kontrollgruppe zu einer signifikanten Verringerung sowohl der Nahrungsaufnahme (p < 0,0001) als auch der Wasseraufnahme (p < 0,0001), während in der HRW-Gruppe keine Verringerung beobachtet wurde. Während der vier Wochen war der Stuhlgang (p = 0,002, Abb. 1E) und das Wasserlassen (p = 0,006, Abb. 1F) in der HI-Gruppe ebenfalls deutlich verringert, während in der HRW-Gruppe keine Wirkung beobachtet wurde. Die Korrelationsanalyse von Spearman ergab, dass der verringerte Stuhlgang der Ratten in der HI-Gruppe positiv mit der Verringerung der Nahrungsaufnahme zusammenhängt (r = 0,43, p = 0,006) und dass die verringerte Urinausscheidung auch positiv mit der verringerten Wasseraufnahme zusammenhängt (r = 0,64, p < 0,0001).

Um die Auswirkungen des Wasserstoffeingriffs auf Plasmametaboliten zu bestimmen, wurde eine LC-MS-basierte pseudotargeted Metabolomics-Analyse an Nüchternplasmaproben durchgeführt. Es wurden 86 Plasmametaboliten identifiziert, bestehend aus Aminosäuren und deren Derivaten, Zwischenprodukten der Glykolyse und des Zitronensäurezyklus, Lipidmetaboliten, Nukleotidmetaboliten, Metaboliten des Harnstoffzyklus, Kohlenhydraten, Cofaktoren/Vitaminen und Hormonen. Um den Unterschied in den Plasmametabolitenspiegeln zwischen den Gruppen zu ermitteln, wurden eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) und eine orthogonale partielle Diskriminanzanalyse der kleinsten Quadrate (OPLS-DA) durchgeführt. Die PCA-Analyse zeigte, dass die HRW- und CON-Gruppen klar nach den Hauptkomponenten (PC) 1 (18,91 %) und 2 (15,26 %) getrennt waren (Abb. 2A). Die Trennung von HI und CON (PC1: 18,94 %, PC2: 14,45 %, Abb. 2B) sowie HRW und HI (PC1: 24,69 %, PC2: 11,68 %, Abb. 2C) wurde ebenfalls beobachtet. Das OPLS-DA-Modell aus dem Plasma-Stoffwechselprofil zeigte eine gute Unterscheidung zwischen HRW und CON (R2X = 0,262, R2Y = 0,991, Q2 = 0,645, Abb. 2D,G), HI und CON (R2X = 0,269, R2Y = 0,968, Q2 = 0,359, Abb. 2E,H), HRW und HI (R2X = 0,325, R2Y = 0,976, Q2 = 0,684, Abb. 2F,I).

Der Unterschied im Plasmametabolitenprofil zwischen den Gruppen wurde sowohl durch PCA- als auch durch OPLS-DA-Analyse identifiziert. (A) PCA-Diagramm von HRW vs. CON; (B) PCA-Diagramm von HI vs. CON; (C) PCA-Diagramm von HRW vs. HI; (D) OPLS-DA-Score-Diagramm von HRW vs. CON; (E) OPLS-DA-Score-Diagramm von HI vs. CON; (F) OPLS-DA-Score-Diagramm von HRW vs. HI; (G–I) Validierungsdiagramm, erhalten aus jeweils 200 Permutationstests.

Differenzielle Metaboliten (DMs) wurden unter Verwendung des Grenzwerts des OPLS-DA-VIP-Scores > 1,0 mit einem ap-Wert < 0,05 bei der fachen Änderung des Expressionsniveaus zwischen zwei beliebigen der drei Gruppen ausgewählt. Wie in der Ergänzungstabelle 1 gezeigt, wurden 35 DMs identifiziert. Im Vergleich zur Kontrollgruppe gibt es 14 bzw. 10 DMs in der HRW- bzw. HI-Gruppe. Zwischen der HRW- und der HI-Gruppe wurden 22 DM identifiziert. Im Vergleich zur Kontrollgruppe waren alle DMs in der HRW-Gruppe herunterreguliert, während alle DMs in der HI-Gruppe hochreguliert waren. Im Vergleich zur HRW-Gruppe waren alle DMs in der HI-Gruppe hochreguliert. Wie in Abb. 3A gezeigt, zeigte das Dendrogramm der hierarchischen Clusterbildung, dass die Plasmaproben in der HRW-Gruppe getrennt von der Kontrollgruppe oder HI-Gruppe geclustert wurden, der Unterschied zwischen der HI-Gruppe und der Kontrollgruppe war jedoch viel kleiner. Die Signalweganreicherungsanalyse basierend auf quantitativen Veränderungen der Metaboliten wurde mit MetaboAnalyst 5.0 (http://www.metaboanalyst.ca) durchgeführt. Die Stoffwechselwege mit einem Impact-Wert > 0,1 und − log(p) > 2,0 gelten als die relevantesten Wege, die an den untersuchten Erkrankungen beteiligt sind. Die Ergebnisse zeigten, dass die DMs zwischen HRW und Kontrollgruppe hauptsächlich im Stärke- und Saccharosestoffwechsel konzentriert waren (Abb. 3B), die DMs zwischen HI und Kontrollgruppe hauptsächlich an der Argininbiosynthese beteiligt waren (Abb. 3C), die DMs zwischen HRW und HI Die Gruppe war hauptsächlich im Glycerolipid-Metabolismus, im Inositphosphat-Metabolismus, im Stärke- und Saccharose-Metabolismus, im Glyoxylat- und Dicarboxylat-Metabolismus sowie im Ascorbat- und Aldarat-Metabolismus angereichert (Abb. 3D).

Analyse unterschiedlicher Metaboliten in Plasmaproben in drei Gruppen. (A) Die hierarchischen Clusterergebnisse für unterschiedliche Metaboliten. (B–D) Die funktionelle Anreicherungsanalyse für unterschiedliche Metaboliten zwischen zwei Gruppen. NAAG N-Acetylaspartylglutaminsäure, CMP Cytidin 5′-monophosphat.

Um die Auswirkungen des Wasserstoffeingriffs auf die Struktur der fäkalen Mikrobiota zu untersuchen, analysierten wir die Bakteriengemeinschaften auf den Proben durch gezielte Sequenzierung des 16S-rRNA-Gens (V3–V4-Region) mit dem Illumina MiSeq. Die hochwertige Sequenzanzahl (CON: 35.896 ± 766, HRW: 36.063 ± 884, HI: 35.630 ± 845) und die Anzahl der operativen taxonomischen Einheiten (OTUs) (CON: 551 ± 76, HRW: 516 ± 11, HI: 559 ± 84). ) waren in den drei Gruppen ähnlich. Vier Messungen der α-Diversität [Chao1 (Abb. 4A), PD-Gesamtbaum (Abb. 4B), Shannon (Abb. 4C) und Simpson (Abb. 4D)] zeigen alle keinen signifikanten Unterschied zwischen der Kontrollgruppe und HRW oder HI-Gruppe. Allerdings war der PD-Gesamtbaumindex in der HI-Gruppe signifikant höher als in der HRW-Gruppe (Abb. 4B). Eine Ähnlichkeitsanalyse (ANOSIM) wurde durchgeführt, um die Unterschiede in der Bakteriengemeinschaft zwischen verschiedenen Gruppen quantitativ zu vergleichen. Wie in Abb. 4E gezeigt, zeigte ANOSIM einen signifikanten Unterschied in der Struktur der Darmmikrobiota zwischen HRW und der Kontrollgruppe (ANOSIM, r = 0,304, p = 0,005). Signifikante Unterschiede in der Bakteriengemeinschaft wurden auch zwischen der HRW- und der HI-Gruppe beobachtet (Abb. 4G, ANOSIM, r = 0,369, p = 0,003). Es wurde jedoch kein signifikanter Unterschied zwischen HI und der Kontrollgruppe beobachtet (Abb. 4F, ANOSIM, r = − 0,065, p = 0,65). Der Wilcoxon-Rangsummentest wurde durchgeführt, um Unterschiede in der relativen Bakterienhäufigkeit zwischen den beiden Gruppen zu identifizieren. Auf der Phyla-Ebene waren, wie in Abb. 4H dargestellt, die dominierenden Phyla der drei Gruppen Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria und Actinobacteria. Im Vergleich zu den Kontrollen war der relative Anteil von Elusimicrobia in der HRW-Gruppe signifikant erhöht, während der Anteil von Deferribacteres und Euryarchaeota in der HRW-Gruppe deutlich verringert war. HI führte nur zu einem deutlichen Anstieg des Anteils von Elusimicrobia. Im Vergleich zur HRW-Gruppe war der Anteil von Elusimicrobia signifikant geringer und Spirochäten und Euryarchaeota in der HI-Gruppe deutlich höher. Auf Familienebene waren, wie in Abb. 4I dargestellt, die dominierenden Familien der fäkalen Mikrobiota Prevotellaceae, Ruminococcaceae, Lachnospiraceae und Lactobacillaceae. Die Häufigkeit von Lactobacillaceae, Peptostreptococcaceae und Elusimicrobiaceae war in der HRW-Gruppe im Vergleich zu den Kontrollen erhöht und die Häufigkeit von Bacteroidaceae und Desulfovibrionaceae verringert. In der HI-Gruppe wurde im Vergleich zu den Kontrollen eine verringerte Häufigkeit bei Porphyromonadaceae und eine erhöhte Häufigkeit bei Elusimicrobiaceae beobachtet. Im Vergleich zur HRW-Gruppe wurde in der HI-Gruppe eine erhöhte Häufigkeit bei Acidaminococcaceae und eine verringerte Häufigkeit bei einigen anderen Phyla (z. B. Lactobacillaceae, Porphyromonadaceae, Peptostreptocccaceae und Sphingomonadaceae) beobachtet. Auf Gattungsniveau, wie in der Ergänzungstabelle 2 gezeigt, zeigten elf und sieben Gattungen im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant unterschiedliche Häufigkeiten in der HRW- bzw. HI-Gruppe. Im Vergleich zur HRW-Gruppe zeigten 23 Gattungen signifikante Unterschiede in der relativen Häufigkeit von Bakterien in der HI-Gruppe.

Analyse der Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaft in drei Gruppen. (A–D) Die Alpha-Diversität der Bakteriengemeinschaft wurde durch Chao1 (A), PD-Ganzbaum (B), Shannon (C) und Simpson (D) gemessen; (E–G) ANOSIM wurde durchgeführt, um die Unterschiede in der Bakteriengemeinschaft zwischen verschiedenen Gruppen quantitativ zu vergleichen. (H,I) Die Community-Bar-Plot-Analyse zeigt die relative Häufigkeit von Mikrobiota in jeder Gruppe auf Stammebene (H) und Familienebene (I), n = 6, in jeder Gruppe.

Um festzustellen, ob die Veränderungen in den mikrobiellen Taxa des Darms die Funktion der Darmmikrobiota verändern würden, wurde die funktionelle Vorhersage auf Ebene 3 des KEGG-Signalwegs von PICRUSt durchgeführt. Wie in Abb. 5 gezeigt, wies die fäkale Mikrobiota von Ratten aus der HRW-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöhte Signalwege auf, die an der Ribosomenbiogenese sowie an Replikation, Rekombination und Reparaturproteinen beteiligt sind. Die HI-Gruppe verfügte über einen deutlich erweiterten Stoffwechselweg, der an der Biosynthese von Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan beteiligt ist. Im Vergleich zur HRW-Gruppe wies die HI-Gruppe weniger Wege auf, die an der Ribosomenbiogenese, Chromosomen sowie Rekombinations- und Reparaturproteinen beteiligt sind.

Differenziell angereicherte KEGG-Wege. Die funktionelle Vorhersage auf Ebene 3 des KEGG-Signalwegs wurde von PICRUSt zwischen HRW und Kontrollgruppe (A), HI und Kontrollgruppe (B), HRW und HI-Gruppe (C) durchgeführt.

Um den möglichen Zusammenhang zwischen unterschiedlich exprimierten Plasmametaboliten und veränderten Darmmikrobiota auf Gattungsebene zu untersuchen, wurde eine multiomische Analyse unter Verwendung des Spearman-Korrelationstests durchgeführt. Die Ergebnisse der Korrelationsanalyse nach Spearman zwischen HRW und der Kontrollgruppe sind in Abb. 6A dargestellt. Die Häufigkeit von Urocansäure hatte die stärkste Korrelation mit Bacteroides (r = 0,944, p < 0,0001). L-Milchsäure zeigte vergleichbare mäßig positive Korrelationen mit Desulfovibrio und Bacteroides. N-Acetyl-l-alanin und N-Acetyl-d-glucosamin zeigten ebenfalls eine mäßig positive Korrelation mit Bacteroides und Elusimicrobium. d-Glucose-6-phosphat zeigte mäßig negative Korrelationen mit Elusimicrobium, Clostridium XI und Barnesiella. Abbildung 6B zeigt die Korrelationsanalyse nach Spearman zwischen HI und der Kontrollgruppe. Apfelsäure hatte die stärkste Korrelation mit Blautia (r = 0,879, p = 0,0002). L-Leucin zeigte eine mäßig positive Korrelation mit Blautia. N-Carbamoyl-l-asparaginsäure, cis-Aconitsäure und Inosin zeigten ebenfalls mäßig positive Korrelationen mit Paraprevotella. N-Carbamoyl-l-asparaginsäure zeigte eine mäßig negative Korrelation mit Bifidobacterium. Abbildung 6C zeigt die Korrelationsanalyse nach Spearman zwischen der HRW- und der HI-Gruppe. L-Phenylalanin zeigte hohe positive Korrelationen mit Sphingomonas (r = 0,866, p = 0,0003), Methylocacterium (r = 0,921, p < 0,0001) und Bosea (r = 0,848, p = 0,0005). Glycerinsäure zeigte auch hohe positive Korrelationen mit Lactobacillus (r = 0,937, p < 0,0001) und Mycoplasma (r = 0,881, p = 0,0002). N6-Methyladenosin zeigte eine hohe positive Korrelation mit Lactobacillus (r = 0,895, p < 0,0001), während es eine starke negative Korrelation mit Methanosphaera aufwies (r = – 0,834, p = 0,0007).

Korrelationsanalysen zwischen deutlich unterschiedlichen Gattungen und unterschiedlichen Plasmametaboliten. Der Korrelationstest nach Spearman wurde zwischen HRW und Kontrollgruppe (A), HI und Kontrollgruppe (B), HRW und HI-Gruppe (C) durchgeführt.

Unsere vorherige Studie berichtete, dass HI bei Ratten zu einer signifikanten Verringerung des Körpergewichts führen kann, HRW dagegen nicht21. In Übereinstimmung mit früheren Studien zeigten die Ergebnisse dieser Studie auch einen deutlichen Rückgang des BW in der HI-Gruppe, während in der HRW-Gruppe kein offensichtlicher Effekt beobachtet wurde. Die Stoffwechselkäfigexperimente zeigten, dass HI die Nahrungsaufnahme, Wasseraufnahme, den Stuhlgang und das Wasserlassen deutlich verringern konnte. Die verminderte Stoffwechselfunktion könnte zur Verringerung des BW in der HI-Gruppe beigetragen haben. Unsere vorherige Studie hat auch gezeigt, dass sowohl die HRW-Aufnahme als auch HI bei normalen Ratten signifikante Veränderungen in mehreren biochemischen Serumparametern hervorrufen können21. Um ein umfassenderes Verständnis der Stoffwechselveränderungen als Reaktion auf die HRW-Aufnahme oder HI zu erhalten, wurde eine LC-MS-basierte pseudotargeted Metabolomics-Analyse durchgeführt. Die OPLS-DA-Modelle zeigten klare Trennungen zwischen zwei der drei Gruppen basierend auf ihren metabolischen Reaktionen. Im Vergleich zur Kontrollgruppe wurden in der HRW- bzw. HI-Gruppe 14 bzw. 10 DM identifiziert. Es ist erwähnenswert, dass alle DMs in der HRW-Gruppe herunterreguliert waren, während alle DMs in der HI-Gruppe hochreguliert waren. 22 DMs wurden zwischen HRW- und HI-Gruppen identifiziert, was darauf hinweist, dass sich die modulatorischen Wirkungen der HRW-Aufnahme auf den Stoffwechsel deutlich unterscheiden von HI. Weitere funktionelle Anreicherungsanalysen legten nahe, dass die DMs hauptsächlich am Stärke- und Saccharosestoffwechsel und der Argininbiosynthese in der HRW- bzw. HI-Gruppe beteiligt waren.

Frühere Studien zeigten, dass eine 4-wöchige HRW-Einnahme den Blutzucker-, Laktat- und Blutharnstoffstickstoffspiegel (BUN) deutlich senken und bei chronisch erzwungenen Schwimmmäusen eine ermüdungshemmende Wirkung entfalten kann22. Es wurde auch berichtet, dass eine dreimonatige HRW-Einnahme den Harnsäurespiegel im Blut bei männlichen Patienten mit Hyperurikämie deutlich senken könnte23. In Übereinstimmung mit diesen Erkenntnissen zeigten unsere Ergebnisse auch, dass eine 6-monatige HRW-Einnahme die Plasmaspiegel von D-Glucose-6-phosphat, L-Milchsäure und Harnsäure herunterregulieren konnte. Darüber hinaus waren auch die Plasmaspiegel von Nukleotiden und ihren Derivaten nach der HRW-Aufnahme verringert, was auf die regulatorischen Auswirkungen der HRW-Aufnahme auf den Nukleotidstoffwechsel hinweist. Bemerkenswerterweise gehörten alle veränderten Nukleotidderivate, einschließlich m6A, Pseudouridin und N2,N2-Dimethylguanosin, zu RNA-Modifikationen. Unter diesen ist m6A die am weitesten verbreitete epigenetische Modifikation der mRNA von Säugetieren und fungiert nachweislich als Schlüsselregulator zahlreicher wichtiger biologischer Prozesse in der normalen Physiologie und bei Krankheiten, darunter Krebs, Herzinsuffizienz, Virusinfektionen und Typ-2-Diabetes24,25 . Es wurde berichtet, dass Pseudouridin als Reaktion auf Serummangel, Wasserstoffperoxid und Hitzeschock in Säugetierzellen dynamische Veränderungen erfährt24. Es wurde bereits berichtet, dass die Verabreichung von H2 die Expression verschiedener Gene regulieren könnte26. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass molekularer Wasserstoff die Genexpression regulieren kann, indem er epigenetische Modifikationen beeinflusst. Darüber hinaus wurden die Plasmaspiegel von N1-Methyl-2-pyridon-5-carboxamid durch die HRW-Einnahme signifikant gesenkt. Nicotinamidadenindinukleotid (NAD+) ist ein wichtiges Coenzym für Redoxreaktionen und daher von zentraler Bedeutung für den Energiestoffwechsel27. Nicotinamidmononukleotid (NMN) ist eines der Substrate für die NAD+-Synthese, das weiter zu N1-Methyl-2-pyridon-5-carboxamid metabolisiert werden kann. Somit kann die HRW-Aufnahme den Energiestoffwechsel regulieren, indem sie die NAD+-Synthese beeinflusst.

Im Gegensatz zur HRW-Aufnahme hatte HI eine hochregulierende Wirkung auf Plasma-DMs. Sechs dieser DMs, darunter L-Citrullin, L-Leucin, Sarkosin, L-Glutaminsäure, N-Carbamoyl-L-Asparaginsäure und NAAG, gehörten zu Aminosäuren und ihren Derivaten. Unter ihnen zeigten die Plasmaspiegel von L-Citrullin in der HI-Gruppe im Vergleich zu den Kontrollen den deutlichsten Anstieg. Bei Ratten wurde gezeigt, dass nur der Darm zirkulierendes Citrullin produziert und die erhöhten Citrullinspiegel entweder durch eine erhöhte Produktion oder eine verminderte Verwertung verursacht werden können28. Die verringerte Auslastung könnte auf eine verminderte Clearance, also Nierenversagen, zurückzuführen sein. In unserer Studie wurde jedoch keine signifikante Veränderung der Kreatinin-Plasmaspiegel beobachtet, was darauf hindeutet, dass die erhöhten Citrullinspiegel nicht durch eine Beeinträchtigung der Nierenfunktion verursacht wurden. Frühere Studien zeigten, dass der Anstieg des Plasma-Citrullins mit einer Verbesserung der Proteinabsorption bei Patienten mit Kurzdarmsyndrom (SBS) im ersten Jahr nach der Resektion korrelierte29. Wir gingen davon aus, dass die erhöhten Citrullin-Plasmaspiegel mit der Verbesserung der Enterozytenfunktion verbunden sein könnten, obwohl dies noch weiter untersucht werden muss. HI verursachte auch einen signifikanten Anstieg der NAAG-Plasmaspiegel. NAAG ist das am weitesten verbreitete und am weitesten verbreitete Dipeptid im Nervensystem von Säugetieren30. Die NAAG-Spiegel im Plasma und in der Liquor cerebrospinalis (CSF) waren viel niedriger als im Gehirngewebe31. Es ist allgemein anerkannt, dass der Anstieg von NAAG neuroprotektiv gegen N-Methyl-d-Aspartat (NMDA)-Rezeptor-vermittelte Neurotoxizität, einschließlich ischämischer Hirnverletzungen, wirkt30. Es wurde erstmals berichtet, dass HI eine neuroprotektive Wirkung bei ischämischem Schlaganfall ausübt, und weitere Studien fanden auch eine schützende Wirkung bei anderen neurologischen Beeinträchtigungen, einschließlich traumatischer Hirnverletzung, Subarachnoidalblutung und neurodegenerativen Erkrankungen32. In Übereinstimmung mit unseren Ergebnissen wurde der HI-induzierte Anstieg von NAAG auch in Kortexgeweben von Mäusen mit ischämischem Schlaganfall beobachtet33. Obwohl die Fähigkeit von molekularem Wasserstoff, Hydroxylradikale abzufangen, seine neuroprotektiven Wirkungen teilweise erklären könnte, könnten die regulatorischen Wirkungen auf NAAG auch für seine schützenden Vorteile verantwortlich sein. Darüber hinaus wurde in unserer Studie auch ein signifikanter Anstieg der Plasmaspiegel von zwei Zwischenprodukten des Zitronensäurezyklus, Cis-Aconitsäure und Äpfelsäure, beobachtet, was darauf hindeutet, dass HI den mitochondrialen Energiestoffwechsel beschleunigen kann. N-Carbamoyl-l-asparaginsäure und Inosin sind Zwischenprodukte des Pyrimidin- bzw. Purinstoffwechsels. Der Anstieg der beiden Metaboliten lässt darauf schließen, dass HI modulierende Wirkungen auf den Nukleosidstoffwechsel haben könnte. Die Plasmaspiegel anderer DMs, einschließlich L-Leucin, Sarkosin, L-Glutaminsäure und L-Milchsäure, variierten geringfügig je nach HI.

Jüngste Studien haben Hinweise darauf geliefert, dass die Modulation der Darmmikrobiota des Wirts einer der Mechanismen sein könnte, die zu den biologischen Auswirkungen des exogenen Wasserstoffverbrauchs beitragen. Qiu et al. zeigten, dass die Behandlung mit gesättigter Wasserstoffsalzlösung die Häufigkeit von Bacteroides, Bifidobacteria und Lactobacillus im Kot modulieren kann, was für die Verbesserung von Fettstoffwechselstörungen bei Mäusen mit hoher Fettdiät verantwortlich sein könnte34. Jin et al. berichteten, dass eine anhaltende H2-Freisetzung im Darm durch Wasserstoff-Nanokapseln die Häufigkeit von Akkermansia muciniphila erhöhen und die mit Stoffwechselstörungen einhergehende Fettlebererkrankung abschwächen könnte35. In dieser Studie führte die Aufnahme von HRW zu signifikanten Veränderungen in der Struktur der Darmmikrobiota, während in der HI-Gruppe keine deutlichen Unterschiede in der Bakteriengemeinschaft beobachtet wurden. Frühere Studien zeigten, dass der Spitzenwert der Wasserstoffkonzentration im Dünndarm nach oraler Aufnahme von 5 ppm HRW etwa 20-mal höher war als nach Inhalation von 4 % Wasserstoffgas36. Der signifikante Unterschied in der Wasserstoffkonzentration im Darm zwischen HRW-Aufnahme und HI kann zu den unterschiedlichen Auswirkungen auf die Mikrobiota-Zusammensetzung beitragen.

In unserer Studie führte die HRW-Aufnahme zu einem signifikanten Anstieg des Anteils von Lactobacillus, Ruminococcus, Clostridium XI, Elusimicrobium, Barnesiella und Aquabacterium sowie zu einem Rückgang von Bacteroides, Anaerotruncus, Desulfovibrio, Mucispirillum und Bifidobacterium. Lactobacillus und Bifidobacterium sind die am häufigsten vorkommenden probiotischen Bakterien. Zu den berichteten positiven Wirkungen zählen unter anderem die Unterstützung der Verdauung, die Verringerung von Verstopfung, die Abwehr von Infektionen, die Vorbeugung von Reisedurchfall und die Linderung von Darmerkrankungen (IBD)37. In unserer Studie führte die HRW-Aufnahme zu einem signifikanten Anstieg der Lactobacillus-Häufigkeit. Die durch die HRW-Aufnahme induzierte erhöhte Häufigkeit von Lactobacillus kann zu den positiven Wirkungen von HRW beitragen. Obwohl HRW auch zu einem deutlichen Rückgang von Bifidobacterium führte, ist die relative Häufigkeit von Bifidobacterium sehr gering. Eine kürzlich durchgeführte klinische Studie zeigte, dass das Trinken von mit Wasserstoff gelöstem alkalischem elektrolysiertem Wasser (AEW) über zwei Wochen bei gesunden Probanden zu einem Anstieg von Bifidobacterium führte38. Die unterschiedlichen pH-Werte (HRW 7,5 vs. AEW 9,5) oder die Dauer der Wasserstoffbehandlung (HRW 6 Monate vs. AEW 2 Wochen) können zu den unterschiedlichen Auswirkungen auf die Bifidobacterium-Spiegel beitragen. Es hat sich gezeigt, dass eine Nahrungsergänzung mit Ruminococcus flavefaciens die antidepressive Wirkung von Duloxetin auf depressives Verhalten abschwächen kann39, obwohl sich die erhöhte Ruminococcus-Konzentration auch bei antidepressivumbedingter Verstopfung als vorteilhaft erwiesen hat39. Frühere Studien zeigten, dass eine 4-wöchige HRW-Einnahme durch die Unterdrückung der Inflammasom-Aktivierung positive Auswirkungen auf depressives Verhalten bei Mäusen haben kann.40 Die antidepressive Wirkung von HRW kann laut unserer Studie durch eine durch die langfristige HRW-Einnahme induzierte Zunahme von Ruminococcus verringert werden. Clostridium XI gehört zur Klasse der Clostridien, von denen berichtet wurde, dass sie Entzündungen und allergische Erkrankungen abschwächen41. Es wurde auch gezeigt, dass Clostridium-Arten unverdauliches Polysaccharid nutzen und viele kurzkettige Fettsäuren (SCFAs) produzieren können, die heute als Schlüsselakteure bei den Wechselwirkungen mit dem Wirt gelten, die sich auf Gesundheit und Krankheit auswirken, insbesondere angesichts neuerer Erkenntnisse ihre Fähigkeit, das Epigenom zu verändern und Auswirkungen auf Gewebe und Organe außerhalb des Darms zu haben42. Der Anstieg der von Clostridium XI abgeleiteten SCFAs könnte ebenfalls zu den Auswirkungen von HRW beigetragen haben. In einer Studie mit 345 chinesischen Personen wurde gezeigt, dass Mitglieder der Gattung Bacteroides bei Typ-II-Diabetikern häufiger vorkommen als bei Kontrollpersonen mit normalem Glukosestoffwechsel43. Über die verbesserte Glukosetoleranz und die Hyperglykämie-senkende Wirkung der HRW-Aufnahme wurde bereits berichtet9,44, was möglicherweise auf die HRW-induzierte Abnahme der Bacteroides-Spiegel zurückzuführen ist. Die Ergebnisse der Spearman-Korrelationsanalysen zeigten eine große Anzahl signifikanter Korrelationen zwischen der Häufigkeit von Bacteroides und DMs, einschließlich Urocansäure, L-Milchsäure, N-Acetyl-d-Glucosamin und N-Acetyl-L-Tyrosin. Die kausalen Zusammenhänge zwischen Veränderungen der Bacteroides-Häufigkeit und Plasma-DMs müssen weiter untersucht werden. Obwohl sich die Mengen anderer Gattungen, darunter Elusimicrobium, Barnesiella, Aquabacterium, Anaerotruncus, Desulfovibrio, Mucispirillum und Bifidobacterium, deutlich veränderten, war ihre relative Häufigkeit sehr gering.

Im Vergleich zur HRW-Gruppe wurden in der HI-Gruppe deutlich geringere Veränderungen der fäkalen Mikrobiota festgestellt. Unter diesen veränderten Gattungen war die Häufigkeit von Blautia und Paraprevotella deutlich erhöht. Blautia gilt als probiotisches Bakterium, das häufig im Kot und Darm von Säugetieren vorkommt45. Die erhöhte Häufigkeit von Blautia könnte zu den Auswirkungen von HI beigetragen haben. Es wurde festgestellt, dass die Gattung Paraprevotella negativ mit dem BMI-Index korreliert46. Übereinstimmend wurde auch eine negative Korrelation zwischen der Häufigkeit der Gattung Paraprevotella und dem Körpergewicht von Ratten beobachtet. Spearman-Korrelationsanalysen ergaben eine große Anzahl signifikanter Korrelationen zwischen der Häufigkeit von Blautia und DMs. Korrelationsanalysen ergaben signifikante negative Korrelationen zwischen der Häufigkeit von Blautia und DMs, einschließlich L-Leucin und Apfelsäure. Die Häufigkeit von Paraprevotella korrelierte negativ mit DMs, einschließlich Inosin, cis-Aconitsäure und N-Carbamoyl-l-asparaginsäure. Die anderen veränderten Gattungen, darunter Elusimicrobium, Propionibacterium, Porphyrobacter, Methanosphaera und Bifidobacterium, wiesen alle eine relativ geringe Häufigkeit auf.

Obwohl sowohl HRW als auch HI positive Auswirkungen auf verschiedene Krankheiten haben, können die ihnen zugrunde liegenden Mechanismen unterschiedlich sein. Was die HRW-Aufnahme betrifft, wurde berichtet, dass viele Arten von Krankheiten, insbesondere Magen-Darm-Symptome wie Verstopfung und Durchfall, von HRW profitieren könnten. Es ist bekannt, dass die Darmmikrobiota eine wichtige Rolle bei Gesundheit und Krankheit spielt. Die modulierende Wirkung von HRW auf die Darmmikrobiota kann erheblich zur Verbesserung dieser Krankheiten beitragen. In unserer Studie zeigten die Ergebnisse von Stoffwechselkäfigexperimenten, dass HI signifikante Veränderungen in der Nahrungs-/Wasseraufnahme von Ratten hervorrief, was positiv mit Veränderungen im Stuhlgang/Urinieren korreliert, während in der HRW-Gruppe kein offensichtlicher Effekt beobachtet wurde. Die Gründe für den Rückgang der Nahrungsaufnahme sind multifaktoriell und umfassen sowohl periphere als auch zentrale Mechanismen47. Hyspler et al. verwendeten Deuteriumgas als metabolischen Tracer, um den Wasserstoffstoffwechsel im Körper von Säugetieren zu quantifizieren, und fanden heraus, dass das Deuterium zu Wasser oxidiert werden kann48. In unserer Studie könnte das eingeatmete Wasserstoffgas wahrscheinlich zu Wasser oxidiert werden, wodurch eine endogene Versorgung mit H2O bereitgestellt wird, was den Rückgang der Wasseraufnahme von Ratten erklären könnte. Darüber hinaus haben wir in unseren früheren Studien vorläufige Beweise dafür geliefert, dass Eukaryozyten über die Fähigkeit zum Wasserstoffstoffwechsel verfügen, was ihre Stoffwechselaktivitäten beeinflussen kann49,50. Es kann daher die Hypothese aufgestellt werden, dass HI seine biologische Rolle durch die Modulation der Stoffwechselfunktion der Mitochondrien ausüben könnte, obwohl dies noch weiter untersucht werden muss.

Eine Einschränkung der vorliegenden Studie besteht darin, dass sich die Forschung zu den Auswirkungen von Wasserstoffeingriffen auf fäkale Mikrobiotaprofile auf die Gattungsebene konzentrierte und keine eingehenden Studien auf Arten- oder sogar Stammebene durchführte. Eine weitere Einschränkung ist das Fehlen nachgewiesener kausaler Zusammenhänge zwischen Veränderungen der Mikrobiota-Profile und Plasmametaboliten. Darüber hinaus sollten weitere Studien auch die Auswirkungen von Wasserstoffeingriffen auf die Produktion von SFCAs bewerten, die eine Schlüsselrolle bei Mikrobiota-Wirt-Interaktionen spielen.

Insgesamt könnten die Ergebnisse dieser Studie grundlegende Daten für die weitere Forschung zur Wasserstoffmedizin liefern. Unsere Ergebnisse geben auch Aufschluss über die Auswirkungen verschiedener Wege der Wasserstoffintervention auf Mikrobiotaprofile, die möglicherweise erheblich zur therapeutischen Wirkung von Wasserstoff bei verschiedenen Krankheiten beitragen.

Die Methoden des Tierversuchs wurden in unserer vorherigen Studie wie folgt beschrieben21: Achtzehn 3 Wochen alte männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 40–50 g wurden von Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Peking, China) gekauft. Die Ratten wurden bei einer konstanten Temperatur von 22–25 °C mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus gehalten und mit normaler Ernährung versorgt. Alle Verfahren wurden vom Institutional Animal Experiment Committee des chinesischen PLA General Hospital genehmigt und in Übereinstimmung mit den Regulations for the Administration of Affairs Concerning Experimental Animals (China) und den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt. Vor dem Experiment wurden die Ratten eine Woche lang an die Laborbedingungen angepasst. Die Ratten wurden dann zufällig in drei Gruppen eingeteilt (6 in jeder Gruppe): (1) Kontrollgruppe: Ratten wurden unter normalen Bedingungen gehalten; (2) HRW-Gruppe: Ratten erhielten zweimal täglich HRW für jeweils 1 Stunde oral; (3) HI-Gruppe: Ratten wurden zweimal täglich jeweils 1 Stunde lang mit HI (4 %) behandelt. Das Experiment dauerte sechs Monate. Frische Kotproben wurden vor der Tötung steril entnommen und sofort zur Mikrobiota-Analyse bei –80 °C gelagert. Nach der Euthanasie wurden sofort Blutproben aus der Pfortader entnommen. Plasmaproben wurden durch Zentrifugieren des Vollbluts bei 1500 g für 10 Minuten bei 4 °C gewonnen und bei –80 °C für eine pseudotargetierte metabolische Analyse gelagert.

HRW (H2-Konzentration > 800 µM) wurde freundlicherweise von Shenzhen Kelieng Biomedical Co. Ltd. (Shenzhen, China) zur Verfügung gestellt und unter Atmosphärendruck bei 23 ± 2 °C in einem Edelstahleimer (KLE-8) gelagert. Die Wasserstoffkonzentration wurde mit einer Wasserstoffelektrode (Unisense A/S, Aarhus, Dänemark) überwacht, um sicherzustellen, dass die Wasserstoffkonzentration von HRW für Ratten über 800 µM gehalten wurde.

Die Ratten wurden in eine transparente, geschlossene Box (72 × 53 × 45 cm, Länge × Breite × Höhe) gebracht, die an den Wasserstoffgasgenerator angeschlossen war, der aus einer Oxy-Hydrogen-Maschine (SG-3000; Gang'an Health Management [Beijing] Co.) bestand ., Ltd., Peking, China) und einem Gasmischer wurde jeweils 1 Stunde lang und zweimal täglich spontan geatmet (4 % H2, 96 % Luft mit 21 % O2). Die Konzentration von Wasserstoff und Sauerstoff in der geschlossenen Box wurde durch Thermal Trace GC-Ultragaschromatographie (Thermo Fisher, MA, USA) überwacht.

Männliche Sprague-Dawley-Ratten (220 ± 20 g) wurden von Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd (Peking, China) gekauft und zufällig in drei Gruppen eingeteilt (n = 8 in jeder Gruppe): CON, HRW und HI Gruppe. Die Stoffwechselfunktion der Ratten wurde 4 Wochen lang überwacht. Die Ratten wurden einmal pro Woche einzeln in Stoffwechselkäfigen (Techniplast, UK) gehalten. Die Nahrungsaufnahme wurde anhand des Restgewichts der Nahrung aus dem Gewicht der am Vortag bereitgestellten Nahrung berechnet. Die Wasseraufnahme wurde berechnet, indem die verbleibende Wassermenge von der am Vortag gemessenen Wassermenge abgezogen wurde. Der Kot und Urin während der 24 Stunden wurde gesammelt und gemessen. Das BW wurde während der vier Wochen überwacht. Die Daten wurden durch wiederholte Zwei-Wege-ANOVA-Messungen mit Tukeys Post-Hoc-Test unter Verwendung von GraphPad Prism 8.0.2 analysiert und als Mittelwert ± SD dargestellt. Die Spearman-Korrelationsanalyse wurde mit GraphPad Prism 8.0.2 durchgeführt.

Um die DMs im Plasma zu identifizieren, wurde der Pseudo-Targeted-Metabolomics-Ansatz durchgeführt, der die Identifizierung und Quantifizierung von 200 Plasmametaboliten ermöglicht. Die Plasmaproben wurden bei 4 °C aufgetaut und gründlich gevortext. Von jeder Probe wurden 100 µL entnommen und in ein 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen überführt. Dann wurden 400 µL eiskaltes Methanol/Acetonitril (1:1, v/v) hinzugefügt. Die Proben wurden durch kräftiges Vortexen gemischt, 20 Minuten lang in einem eiskalten Wasserbad-Ultraschallgerät beschallt und 1 Stunde lang bei –20 °C gehalten. Anschließend wurden die Proben 20 Minuten lang bei 4 °C und 14.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein Glasprobenfläschchen überführt und bei 4 °C vakuumgetrocknet. Anschließend wurden 100 µL Acetonitril/Wasser (1:1, Vol./Vol.) zugegeben und anschließend 20 Minuten bei 4 °C und 14.000 g zentrifugiert. Die resultierenden Überstände wurden für die Metabolomics-Analyse verwendet. Die Qualitätskontrollproben (QC) wurden durch Mischen gleicher Volumina aller Plasmaproben mit allen anderen oben beschriebenen Schritten hergestellt.

Die chromatographische Trennung des Plasmas wurde auf einem Flüssigkeitschromatographiesystem der Klasse I von Waters mit einer ACQUITY UPLC BEH Amide-Säule (1,7 µm, 2,1 × 100 mm Säule, Waters) durchgeführt. Das mobile Phasensystem besteht aus 25 mM Ammoniumacetat + 25 mM Ammoniak (pH 9,75) (A) und Acetonitril (B). Die Säulentemperatur wurde bei 40 °C gehalten und die Flussrate betrug 0,3 ml/min. Das Probeninjektionsvolumen betrug 2 µL. Der lineare Gradient für die mobile Phase B war wie folgt: 0–1 Minute 95 % B; 1–14 Min., 95 % bis 65 %; 14–16 Min., 65 % bis 40 %; 16–18 Min., 40 % B; 18–18,1 Min., 40 % bis 95 %; 18,1–23 Min., 95 % B. Die QC-Proben wurden während des gesamten Analyselaufs in regelmäßigen Abständen (alle 6 Proben) injiziert.

Die Massendatenerfassung wurde mit einem 5500 QqQ MS (AB SCIEX) durchgeführt. Die Erkennung erfolgte im positiven und negativen ESI-Modus. Die MS-Parameter wurden wie folgt eingestellt: Hüllgastemperatur 350 °C; Trockengastemperatur, 350 °C; Hüllgasfluss, 11 l/min; Trockengasfluss, 10 l/min; Kapillarspannung, 4000 V bzw. – 3500 V im positiven bzw. negativen Modus; Düsenspannung 500 V; und Verneblerdruck: 30 psi. Zur Detektion wurde der Multiple Reaction Monitoring (MRM)-Modus verwendet. Die Verweilzeit jedes Ionenpaares betrug 3 ms und die Gesamtzykluszeit betrug 1,263 s. Die ursprünglichen MRM-basierten Metabolomics-Daten wurden wie zuvor berichtet mit MRMAnalyzer (R) analysiert34.

Zunächst wurde eine unbeaufsichtigte PCA-Analyse durchgeführt, um die allgemeinen Trends für alle Proben zu visualisieren. Anschließend wurde ein überwachtes OPLS-DA-Modell verwendet, um die Proben zu klassifizieren und die relevanten Variablen im Zusammenhang mit der Probengruppierung zu finden. Zur Durchführung der PCA- und OPLS-DA-Analyse wurde die SIMCA-p-Software (Version 14.1, https://www.sartorius.com) verwendet. Das Modell wurde mit 200 zufälligen Permutationen validiert, um die prädiktive Variation des Modells zu bewerten. Die aus dem OPLS-DA-Modell ermittelten VIP-Werte (Variable Important in Projections) wurden verwendet, um den Beitrag jeder Variablen zum etablierten Modell zu bewerten. Metaboliten mit VIP > 1 und p < 0,05 werden als signifikant veränderte Metaboliten identifiziert. MetaboAnalyst 5.0 (https://www.metaboanalyt.ca/) wurde für die funktionelle Anreicherungsanalyse der gestörten Metaboliten verwendet. Alle p-Werte wurden mithilfe der Benjamini-Hochberg-Mehrfachtestkorrektur korrigiert.

Die gesamte genomische DNA wurde mit dem QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit (QIAGEN, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers aus Fäkalien isoliert. Qualität und Quantität der extrahierten DNA wurden mit einem NanoDrop ND-2000-Spektrophotometer (Thermo Fisher Scientific, USA) gemessen. Die V3-V4-Region des 16S-rRNA-Gens wurde mit dem Vorwärtsprimer 5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′ und dem Rückwärtsprimer 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′ amplifiziert. Die probenspezifischen Barcodes wurden an den Enden der Primer angebracht. Das PCR-Programm wurde wie folgt eingestellt: 98 °C 10 Min., 25 Zyklen von 98 °C 15 Sek., 55 °C 30 Sek., 72 °C 30 Sek. und 72 °C 5 Min. Die Amplifikationsprodukte wurden gereinigt und dann auf der Illumina MiSeq-Plattform mit dem MiSeq Reagent Kit v3 sequenziert.

Die Sequenzierungsdaten wurden mit dem QIME-Paket (Version 1.9.1) analysiert. Hochwertige Paried-End-Lesevorgänge (Qualitätsfaktor ≥ 20) wurden mithilfe von FLASH (Version 1.2.11) zu Tags zusammengesetzt. Tags mit > 97 % Sequenzidentität wurden mithilfe von USEARCH (Version 10.0) in OTUs geclustert, und UCHIME (Version 8.1) wurde verwendet, um chimäre Sequenzen zu identifizieren und zu entfernen. Eine repräsentative Sequenz jeder OTU wurde ausgewählt und BLAST unterzogen, um mithilfe der SILVA-Datenbank (Version 132) eine taxonomische Klassifizierung zuzuweisen.

Die Alpha-Diversitätsindizes wurden von QIIME (Version 1.9.1) berechnet. Eine einseitige Ähnlichkeitsanalyse (ANOSIM) wurde durchgeführt, um die Unterschiede in den Bakteriengemeinschaften zwischen den Gruppen zu bestimmen. Die Unterschiede in den Alpha-Diversitätsindizes und der relativen Häufigkeit von Stämmen, Familien und Gattungen zwischen den Gruppen wurden mithilfe des t-Tests bei unabhängigen Stichproben (für die normalverteilten Daten) oder des Wilcoxon-Rangsummentests (für die nicht normalverteilten Daten) berechnet ). Ein p-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die phylogenetische Untersuchung von Gemeinschaften durch Rekonstruktion unbeobachteter Zustände (PICRUSt) wurde verwendet, um relative Informationen zur Signalweghäufigkeit der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) zu erhalten51,52,53,54.

Die Spearman-Korrelation zwischen der relativen Häufigkeit von Gattungen und der Menge an Plasmametaboliten wurde in der R-Software (Version 3.2.1, https://www.r-project.org/) berechnet und mit dem ComplexHeatmap-Paket (Version 2.9.3, http) visualisiert ://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/ComplexHeatmap.html) in R-Software (Version 3.2.1).

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Arbeit wurde von Military Logistics Key Open Research Projects (BHJ17L018) unterstützt.

Diese Autoren trugen gleichermaßen bei: Fei Xie, Xue Jiang und Yang Yi.

Fakultät für Umwelt und Leben, Technische Universität Peking, Nr. 100, Pingleyuan, Bezirk Chaoyang, Peking, 100124, China

Fei Xie, Xue Jiang, Yang Yi, Zi-Jia Liu, Chen Ma, Jin He, Zhi-ming Xun, Meng Wang, Meng-yu Liu, Yao Mawulikplimi Adzavon, Peng-xiang Zhao und Xue-mei Ma

Beijing Molecular Hydrogen Research Center, Peking, 100124, China

Fei Xie, Xue Jiang, Yang Yi, Zi-Jia Liu, Chen Ma, Jin He, Zhi-ming Xun, Meng Wang, Meng-yu Liu, Yao Mawulikplimi Adzavon, Peng-xiang Zhao und Xue-mei Ma

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X.-M. und FX entwarf das Gesamtprojekt. FX, XJ, YY, Z.-jL und CM führten die Tierversuche durch. JH und Z.-X. führten die LC-MS-basierte pseudotargeted Metabolomics-Analyse durch, MW und M.-L. führte die 16S-rRNA-Gensequenzierung durch, FX analysierte die Daten und verfasste das Manuskript, Y.-A., P.-Z. und X.-M. überarbeitete das Manuskript. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Xue-mei Ma.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Xie, F., Jiang, X., Yi, Y. et al. Verschiedene Auswirkungen der Aufnahme von wasserstoffreichem Wasser und der Inhalation von Wasserstoffgas auf das Darmmikrobiom und die Plasmametaboliten von Ratten im Gesundheitszustand. Sci Rep 12, 7231 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-11091-1

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Eingegangen: 01. August 2021

Angenommen: 31. März 2022

Veröffentlicht: 04. Mai 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-11091-1

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